| 研究課題名 | 動物細胞ゲノムにおける単一DNA二重鎖切断誘導とその修復モニタリング技術の開発 |
| レコードタイプ | 研究実績報告 |
| 報告年度 | 2004 |
| 研究期間 | 2003-2004 |
| 研究課題番号 | 15590259 |
| 研究代表者 | 高田 穣 (タカタ ミノル) 川崎医科大学・医学部・教授 |
| 研究代表者番号 | 30281728 |
| 研究機関 | 川崎医科大学 研究機関番号：35303 |
| 研究分担者 | 石合 正道
(イシアイ マサミチ)
川崎医科大学・医学部.
助教授
(90298844)
松下 暢子 (マツシタ ノブコ) 川崎医科大学・医学部. 助手 (30333222) 平野 世紀 (ヒラノ セイキ) 川崎医科大学・医学部. 助手 (20368616) 北尾 洋之 (キタオ ヒロユキ) 川崎医科大学・医学部. 助手 (30368617) |
| 研究種目 | 基盤研究(C) 研究種目コード：320 |
| 審査区分 | 一般 区分コード：03 |
| 研究分野[3] | 医化学一般 研究分野コード：6905 |
| キーワード | DNA二重鎖切断 / DNA修復 / I-SceI / TAT配列 / エストロジェン受容体 |
| 研究概要 | 本研究では、高等動物培養細胞株を用いて、単一の染色体部位にDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し、その後の修復過程をリアルタイムモニタリングするシステムを構築する事を試みた。原理的には以下のような方法論である。特異的配列を認識してDNAを切断する制限酵素を、認識配列を含んだ人工基質をあらかじめ染色体に1コピー組み込んだ細胞に導入する。導入法として、18塩基認識制限酵素I-SceI細胞内移行シグナルの11アミノ酸(TAT配列)を付加した組み換え蛋白を作製する。培養液に添加することで細胞内導入が高効率に期待できる。また、エストロジェン受容体との癒合蛋白として発現させ、タモキシフェン添加によって一気に核内に移行させる。発光蛋白でマーキングした修復分子と切断部位をリアルタイムイメージングしたり、DNA末端形状をゲノムサザンブロットでモニターしたり、クロマチン免疫沈降によって修復蛋白のリクルートメントを検討出来る可能性がある。 I-SceI制限酵素とTAT配列との融合蛋白(TAT-I-SceI)、さらにGSTとの融合蛋白(GST-TAT-I-SceI)を大腸菌で発現させ精製した。現在、精製条件の最適化を行っている。 また、I-SceIとERとの融合蛋白(ER-I-SceI-ER、ふたつのエストロジェン結合ドメインでI-SceIをはさんでいる)を作製したところ、核内への移動は迅速であったが、本来のI-SceIにくらべ二桁ほどDSB導入効率が低下していた。I-SceIのN末へのGFPの融合は機能を阻害しないことがわかっているので(未発表データ)、ER-CFP-I-SceI融合蛋白を作製し細胞に発現させた。現在その細胞でうまくI-SceIが制御可能かどうかの検討中である。 |
| 発表文献 | M Ishiai et al.：
"DNA crosslink repair protein SNM1A interacts with PIAS1 in nuclear focus formation."
Mol Cell Biol. 24.
10733-10741
(2004)
Hatanaka A. et al.： "Similar Effects of Brca2 Truncation and Rad51 Paralog Deficiency on Immunoglobulin V Gene Diversification in DT40 Cells Support an Early Role for Rad51 Paralogs in Homologous Recombination." Mol Cell Biol. 25. 1124-1134 (2005) Hirano S. et al.： "Functional relationships of FANCC to homologous recombination, translesion synthesis, and BLM." EMBO J. 24. 418-427 (2005) Hamimes S. et al.： "A Novel RNA-recognition motif (RRM)-containing protein involved in the cell response to cisplatin in vertebrates." J Biol Chem. 14(Epub ahead of print). (2004) Yamamoto K. et al.： "Fanconi anemia protein FANCD2 promotes immunoglobulin gene conversion and DNA repair through a mechanism related to homologous recombination." Mol Cell Biol. 25. 34-43 (2005) |