| 研究課題名 | 血漿PAFアセチルヒドロラ-ゼの活性調節機構の解明を目的とした遺伝生化学的研究 |
| レコードタイプ | 研究実績報告 |
| 報告年度 | 1996 |
| 研究期間 | 1995-1996 |
| 研究課題番号 | 07672386 |
| 研究代表者 | 唐沢 健 (カラサワ ケン) 帝京大学・薬学部・講師 |
| 研究代表者番号 | 50186029 |
| 研究機関 | 帝京大学 研究機関番号：32643 |
| 研究種目 | 基盤研究(C) 研究種目コード：320 |
| 審査区分 | 一般 区分コード：03 |
| 研究分野[2] | 生物系薬学 研究分野コード：683 |
| キーワード | PAT / PAFアセチルヒドロラ-ゼ / 遺伝子クロ-ニング |
| 研究概要 | 1.モルモット血漿PAFアセチルヒドロラ-ゼのcDNAクロ-ニング(初年度) 精製モルモット血漿PAFアセチルヒドロラ-ゼ(分子量63kDa)をリジルエンドペプチダ-ゼ処理し、得られた9個のペプチド断片のアミノ酸配列を気相法シ-クエンサ-により決定した。この配列をもとに、モルモット肝臓mRNAから調製した1st strand cDNAをテンプレ-トとしてPCRを行い、約600bpの特異的フラグメントを得た。これをプロ-ブとし、モルモット肝臓cDNAライブラリ-30万pfuををスクリ-ニングした結果、4個のポジティブクロ-ンを得た。ところがN末端部分が含まれていないことが判明したため、5'RACE法により欠損部分を得た。塩基配列より予想されるタンパクは436アミノ酸(推定分子量49kDa)から成り、セリンエステラ-ゼに典型的なモチ-フとアスパラギン結合型糖鎖により修飾可能な配列3個所を有していた。 2.組換モルモット血漿PAFアセチルヒドロラ-ゼの発現と特異的抗体の作製(最終年度) His tagを有する発現ベクタ-を用いて大腸菌に発現させ、本遺伝子産物が活性を持つことを確認した。リコンビナント酵素をNi^+カラムおよびSDS-PAGEによって精製した。リコンビナントタンパクをウサギに免疫して特異的抗体を得た。この抗体は血漿中の63kDaの蛋自質と反応することから、本酵素は糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けている可能性が考えられる。この修飾の生理的意義については今後明らかにしていかなければならない。 このほかヒト酵素のcDNAクロ-ニングと、アデノウイルスベクタ-を用いた哺乳動物細胞での発現実験を行った。現在、ゲノムDNAのクロ-ニングを実施中である。これまでに肝臓およびマクロファ-ジでエストラジオ-ルによって、またマスト細胞ではインタ-ロイキンにより本酵素の発現調節が行われていることが示唆されている。今後、プロモ-タ-領域の解析と免疫化学的手法を組みあわせることにより、分子レベルでこれらの発現調節機構を解析していく方針である。さらに病態への関与についても検討していきたい。 |
| 発表文献 | Ken karasawa et al.: "Cloning,expression and characterization of plasma platelet activating factor-acetylhydrolase from Guinea Pig" Journal of Biochemistry. 120. 838-844 (1996) Toru Sasaki et al.: "A distribution study of ^<11>C platelet-activating factor (PAF)analogs in normal and tumor-bearing mice" Nuclear Medicine and Biology. 23. 309-314 (1996) |