| 研究概要 |
ラット脳において、phosphoneuroprotein 14 (PNP14)に対する抗体を用いて免疫化学的に詳細に解析した結果、PNP 14にはそのファミリ-タンパク質が存在することを明らかにした。ファミリ-タンパク質はラット脳cDNAライブラリ-からクロ-ニングされたアミノ酸140基より構成される脳特異的タンパク質synuclein (SYN) 1であった。ここで用いた抗PNP 14はPNP 14を抗原に作製したポリクロ-ナル抗体であることから、SYN1に対する交差反応性は両タンパク質間のN末側から分子中央部に存在する疎水領域まで、およびC末側10アミノ酸残基間における高い相同性によるものと考えられた。SYNは同一遺伝子からオルタナティブスプライシングにより生成するSYN1,2,3と三種類の分子種の存在が示唆されていることから、各々の分子種に対する特異抗体を調製し、免疫組織化学的手法を用いてラット脳における局在について解析した。さらに、すでに得ている全長PNP 14 cDNAがSYS cDNAとハイブリダイズしたことから、それぞれの分子種に対する特異的プロ-ブを調製し、in situハイブリダイゼ-ション法に適用してラット脳内mRNAの発現についても解析した。a)牛大脳から精製したSYN1の一次構造について、ブロックされているN末アミノ酸と続く3残基を除いた136アミノ酸残基をタンパク化学的に決定した。その結果、ヒトとは8残基、ラットとは9残基にアミノ酸の置換が認められ、両者とも94%が同一アミノ酸であった。b)PNP 14,SYN1,2,3において、それぞれ特異的なアミノ酸配列に対する合成ペプチドを用いてポリクロ-ナル抗体を作成した。イムノブロットを用いて検討し、抗体が対応する各々の分子種に対してのみ反応することを確認した。c)特異抗体を用いてラット脳内局在性について検討した結果、いずれのタンパク質も大脳では海馬>臭球に、小脳では顆粒層>分子層に発現していた。d)各々の分子種に特異的塩基配列である領域を用いて、アンチセンス、センスリボプロ-ブを調製し、in situハイブリダイゼ-ションを行った。mRNAの高発現部位は各々のタンパク分子の発現部位とほぼ同様であることを明らかにした。 |