| 研究課題名 | 甘草毛状根でのチトクロ-ムP-450遺伝子の導入によるグルチルリチン酸の生産 |
| レコードタイプ | 研究実績報告 |
| 報告年度 | 1996 |
| 研究期間 | 1995-1996 |
| 研究課題番号 | 07672377 |
| 研究代表者 | 広谷 正男 (ヒロタニ マサオ) 北里大学・薬学部・助手 |
| 研究代表者番号 | 50050547 |
| 研究機関 | 北里大学 研究機関番号：32607 |
| 研究種目 | 基盤研究(C) 研究種目コード：320 |
| 審査区分 | 一般 区分コード：03 |
| 研究分野[2] | 生物系薬学 研究分野コード：683 |
| キーワード | Glycyrrhiza uralensis / チトクロ-ム P-450 / グリチルリチン酸 / hairy root culture / PCR |
| 研究概要 | 本研究を遂行するためには、glycyrrhizin生合成の最終段階で関与すると推定されるチトクロ-ムP-450遺伝子を単離し,これをA.rhizogenesを介して甘草属植物に導入するため,第一に,各種甘草でのA.rhizogenesを介した外来遺伝子導入条件と導入遺伝子の検出条件を検討した。これと平行して,第二に,チトクロ-ムP-450遺伝子単離のための諸条件を検討した。6種の甘草属植物を無菌的に播種して得られた芽生えあるいは幼植物体より得た葉,茎などを材料として用い,これに3株のA.rhizogenesを直接接種法により塗布感染処理した。生じた不定根を切り取り,Claforanを含むMurashige&Skoog寒天培地で除菌処理した後opineの存在を調べた。以上のようにして,6種の甘草より27株の毛状根の誘導に成功した。 次に約40週水耕栽培しglycyrrhizinが検出されたGlycyrrhiza uralensisの根よりRNAを抽出した。このRNAを用いてRT-PCR法により逆転写反応を行い得られたcDNAをtemplateとしてsense側のprimerをこれまで植物から単離されたP-450遺伝子の保存領域を含むCおよびDドメインよりdesignし,antisense側はprimerM13M4を用いてPCRを行った。PCRproduct中,500bp付近に数本のバンドが検出された。これらのバンドからDNAを回収しTAcloning kitを用いてpCRTMIIベクタ-に組み込んだ。インサ-トの確認はM13forwardprimerおよびM13reverse primerを用いて,コロニ-PCRを行うことにより確認した。500bp付近にインサ-トを持つことが確認されたコロニ-から,アルカリ-SDS法を用いてプラスミドを抽出し,dideoxy法によりインサ-トの塩基配列を決定した。これまでに計33クロ-ンのシ-クエンスを行ったが,現在までのところ,P-450遺伝子の判定基準となるヘム結合中心であるシステインのコドンをもつクロ-ンは得られていない。 現在,水耕栽培でglycyrrhizinの生成が確認されているG.uralensisとglycyrrhizinが生成されないことが知られているG.echinataの双方から抽出したtotalRNAからcDNAを調製しsubtractive hybridization法によりP-450遺伝子を単離することを試みている。 |
| 発表文献 | K.Kawaguchi et al.: "Biofransformation of digitox : geuin by cultured ginsong cells" Phytochomistry. 42. 667-669 (1996) Y.Zhou et al.: "Flavonoids and phenylethanoids from hairy root cultures of s.baialensis" Phytochemistry. 44. 83-87 (1997) |