| 研究課題名 | インシュリン情報伝達系に基づく生理活性物質の化学選択性評価法の創製 |
| レコードタイプ | 研究実績報告 |
| 報告年度 | 2000 |
| 研究期間 | 1999-2000 |
| 研究課題番号 | 11740408 |
| 研究代表者 | 小澤 岳昌 (オザワ タケアキ) 東京大学・大学院・理学系研究科・助手 |
| 研究代表者番号 | 40302806 |
| 研究機関 | 東京大学 研究機関番号：12601 |
| 研究種目 | 奨励研究(A) 研究種目コード：210 |
| 研究分野[2] | 分離・精製・検出法 研究分野コード：346 |
| キーワード | インシュリン情報伝達 / プロテインスプライシング / 緑色蛍光蛋白質(GFP) / VDE / dnaE / リン酸化 / ルシフェラーゼ / 蛋白質間相互作用 |
| 研究概要 | インシュリン情報伝達系に基づく生理活性物質の化学選択性を評価するための分析法の開発を行った. 1.蛋白質のスプライシング反応を用いた蛋白質-蛋白質間相互作用を検出するための新規方法を開発した.相互作用検出用プローブは,2つの蛋白質に各々連結される2つのプローブ分子a,bからなる.プローブaは,スプライシングを起こす蛋白質VDEのN末側に緑色蛍光蛋白質(GFP)のN末側を,プローブbは,VDEのC末側にGFPのC末を結合した.これらプローブを相互作用する蛋白質カルモジュリンとM13ペプチドに連結し,大腸菌内で発現させた.カルモジュリンとM13存在下では510nmの蛍光極大が観測された.カルモジュリンとM13との相互作用により,VDEのN末とC末が近接しスプライシング反応が起こり,GFPが形成されたことを確認した.本法は細胞種を問わず原理的にいかなる蛋白質-蛋白質間相互作用を解析できる一般性のある方法であることを示した.(Anal.Chem.72,5151-5157(2000)) 1.インシュリン情報伝達過程のチロシンのリン酸化とSH2ドメインとの相互作用を指標とした生理活性物質の化学選択性を評価する新規方法を開発した.蛋白質間相互作用を検出する基本原理は(1)に従った.スプライシングを起こす蛋白質としてdnaE蛋白質を用い,スプリットしたルシフェラーゼにdnaEをつなげたペプチドをプローブ分子とした.リン酸化蛋白質IRS-1及びその標的蛋白質SH2ドメインをプローブに接続し,インシュリンリセプターを過剰発現させた細胞内に発現させた.インシュリンを添加すると,濃度依存的にスプライシング反応が起こりルシフェラーゼ活性が上昇することが分かった.(投稿中) |
| 発表文献 | Ｔ．Ｏｚａｗａ， ｅｔ ａｌ．：
"Ａ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ"
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７２.
5151-5157
(2000)
Ｔ．ｏｚａｗａ， ｅｔ ａｌ．： "Ｈｏｗ Ｃａｎ Ｃａ┣Ｄ１２＋┫Ｄ１ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｇ┣Ｄ１２＋┫Ｄ１？ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎｄ ＦＴ−ＩＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ" Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９. 14495-14503 (2000) Ｍ．Ｓａｔｏ， ｅｔ ａｌ．： "Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉα ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ" Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７２. 5918-5924 (2000) Ｚ．Ｑｕａｎ， ｅｔ ａｌ．： "Ａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）" Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ． ４２３. 197-203 (2000) |