電子伝達蛋白質と超分子複合体を形成する亜硝酸還元酵素の構造と分子進化に関する研究

研究課題名	電子伝達蛋白質と超分子複合体を形成する亜硝酸還元酵素の構造と分子進化に関する研究
レコードタイプ	研究実績報告
報告年度	2005
研究期間	2004-2005
研究課題番号	16710156
研究代表者	井上豪　 (イノウエツヨシ)　大阪大学・大学院・工学研究科・助教授
研究代表者番号	20263204
研究機関	大阪大学　研究機関番号：14401
研究種目	若手研究(B)　研究種目コード：260
研究分野[3]	生物分子科学　研究分野コード：2401
キーワード	亜硝酸還元酵素 / 電子伝達銅蛋白質 / 超分子複合体 / X線構造解析 / 電子伝達経路
研究概要	亜硝酸還元酵素(NIR)は、脱窒過程の一部である亜硝酸イオンを一酸化窒素に還元する反応を触媒する酵素である。NIRのうち、通常の銅型NIRはサブユニット(単量体)あたり電子受容部位として働くタイプ1銅と、亜硝酸還元部位として働くタイプ2銅の二つの銅結合部位を持ち、3量体構造をとることが知られている。これに対してHyphomicrobium denitrificans A3151株由来の銅型NIR(HdNIR)は単量体あたり2つのタイプ1銅(type 1 Cu_N,type 1 Cu_C)と1つのタイプ2銅を持ち、6量体構造をとる。 HdNIRは、そのアミノ酸配列のN末端側にブルー銅タンパク質のプラストシアニンと相同性のあるドメイン(N-terminalドメイン)とC末端側に既知のNIRと相同性のあるドメイン(C-terminalドメイン)からなり、Nドメインにはtype 1 Cu_N、Cドメインにはtype 1 Cu_Cとtype 2 Cuが含まれている。これまでにNativeおよびC260Aの結晶化を行い、2.4Å分解能までのX線回折強度データを収集した(Acta Cryst.,D60,2383-2386(2004))。銅イオンを利用したMAD法による構造解析を試みたが、最終的には、分子置換法に成功し、2.4Å分解能でR値18%の精密構造を得た。構造解析の結果、HdNIRのN末端ドメインのtype 1銅の周囲に存在する、Gly74,Gly38,Ala75,Met40,Ile35などの疎水パッチ同士が結合し、3量体構造どうしがface-to-faceで向き合うような構造を有していた。NIRドメインのtype 1とtype 2の銅イオンの位置は、12.7Å離れ、N末端ドメインのtype 1と、NIRドメインのtype 1とは50.4Å離れていたが、隣のNIRドメインのtype 1との距離が24.7Åと近く、異なる分子への電子伝達経路が考えられた。ストップドフローやパルスラジオリシスなどの生化学実験の結果から、HdNIRの生理的電子供与体であるシトクロムc_<550>は、2系統の電子伝達経路でHdNIRに電子を供与し、N末端ドメインのtype 1銅に電子を渡す速度よりも、NIRドメインのtype 1銅へ電子を渡す速度が非常に速いことが判明した。これら2つの電子伝達経路を構造から議論した。
発表文献	Xie.Y et al.：　 "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of dissimilatory nitrite reductase isolated from Hyphomicrobium denitrificans A3151" 　Aeta Cryst. D60. 　2383-2386　 (2004) 　 T.Nakamura et al.：　 "Crystallization and X-ray diffraction analysis of thioredoxin peroxidase from the aerobic hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix K1" 　Aeta.Cryst. F61. 　323-325　 (2004) 　 H.Tamura et al.：　 "Crystallization and preliminary X-ray analysis of methylthioribose-1-phosphate isomerase from Bacillus subtiles." 　Aeta Cryst. F61. 　595-598　 (2005) 　 T.Nakamura et al.：　 "Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a chitin-binding domain of hyperthermophilic chitinase from Pyrococcus furiosus." 　Aeta Cryst. F61. 　476-478　 (2005) 　 Kilunga K.B et al.：　 "Structural and mutational analysis of Trypanosoma Bruoei Prostaglandin H2 reductase provides insight into the catalytic mechanism of aldo-ketoredutases" 　J.Biol.Chem. 280. 　26371-26382　 (2005) 　 T.Inoue et al.：　 "The first Determination of the Inhibitor Complex Structure of Human Hematopoietic Prostaglandin D Synthase" 　J.Biochem. 135. 　279-283　 (2004) 　 T.Inoue et al.：　 "Structural mechanism for coordination of proofreading and polymerase activities in archaeal DNA polymerases." 　J.Mol.Biol. 351. 　291-298　 (2005) 　 T.Knoshita et al.：　 "Structural Basis of Compound Recognition by Adenosine Deaminase." 　Biochemistry 44. 　10562-10569　 (2005) 　 T.Yamamoto et al.：　 "Crystal Structure of TBP-interacting protein(Tk-TIP26) and implications for its inhibition mechanism of the interaction between TBP and TATA-DNA." 　Protein Science (In Press). 　 (2005) 　 T.Nakamura et al.：　 "Crystal Structure of Thioredoxin Peroxidase of an Aerobic Hyperthermophilic Archaeon, Aeropyrum pernix K1." 　Protein (In Press). 　 (2005) 　 H.Matsumura et al.：　 "Crystal structure of intein homing endonuclease II encoded in DNA polymerase gene from Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakaraensis strain KOD1." 　Proteins : Structure Function and Bioinformatics (In Press). 　 (2005) 　 H.Adachi et al.：　 "Temperature-Screening System for Determining Protein Crystallization Conditions" 　Jpn.J.Appl.Phys. 44. 　A4080-A4083　 (2005) 　 K.Takeuchi et al.：　 "Protein Crystal Growth using Laser-Processed Seed Crystals" 　Jpn.J.Appl.Phys. 44. 　A3177-A3179　 (2005) 　 H.Adachi et al.：　 "Protein Crystallization by Combining Laser Irradiation and Solution-Stirring Techniques." 　Jpn.J.Appl.Phys. 44. 　1365-1366　 (2005) 　 H.Adachi et al.：　 "Solution stirring initiates nucleartion and improves the quality of adenosine deaminase crystals" 　Aeta.Cryst. D61. 　759-762　 (2005) 　 M.Kashii et al.：　 "Femtosecond Laser Processing of Protein crystals in Crystallization Drop." 　Jpn.J.Appl.Phys. 44. 　L873-L875　 (2005) 　 H.Kitano et al.：　 "Precessing of Membrane Protein Crystal Using Ultlaviolet Laser Irradiation" 　J.Biosci.Bioeng. 100. 　50-53　 (2005)