バキュロウイルスディスプレイによる膜タンパク質複合体解析

研究課題名	バキュロウイルスディスプレイによる膜タンパク質複合体解析
レコードタイプ	研究実績報告
報告年度	2005
研究期間	2004-2005
研究課題番号	16310147
研究代表者	浜窪隆雄　 (ハマクボタカオ)　東京大学・先端科学技術研究センター・教授
研究代表者番号	90198797
研究機関	東京大学　研究機関番号：12601
研究分担者	先浜俊子　 (サキハマトシコ) 　東京大学・先端科学技術研究センター. 　科学技術振興特任教員(特任助教授)　 (70187061) 　　増田一之　 (マスダカズユキ) 　東京大学・先端科学技術研究センター. 　科学技術振興特任教員(特任助手)　 (20345151)
研究種目	基盤研究(B)　研究種目コード：310
審査区分	一般　区分コード：03
研究分野[3]	生物分子科学　研究分野コード：2401
キーワード	核内受容体 / 磁性ビーズ / プロテオミクス / 転写複合体 / HNF4α
研究概要	発芽型バキュロウイルス(BV)に発現した膜タンパク質は、GPCR(BLT1,CCR2,CCR5,edg1,AT1a,AT2,D1,D5),アデニレートシクラーゼ、γセクレターゼ複合体(プレセニリン、ニカストリン、APH1,PEN2)、ペプチドトランスポーター(PepT1)である。ケモカイン受容体を除いてすべてBV画分に高い活性を回収した。BLT1-BVでは、リガンドのLTB4を蛍光標識することによりBVでの結合アッセイを開発し、ドパミン受容体では、三量体Gタンパク質とアデニレートシクラーゼを共感染することにより、BV上でリガンド依存性のCAMP産生シグナルが計測され、再構成できることが示された。γセクレターゼはBV上で活性型プレセニリンが再構成され、上記4種の膜タンパク質がC99からβアミロイドの生成に必要十分であることが示された。これらのBVをウイルスエンベロープタンパク質gp64トランスジェニックマウスに免疫することにより、CCR2,CCR5,edg1,ニカストリン、PepT1に対する特異モノクローナル抗体が作製でき、また機能を阻害する抗体や癌細胞に対してADCC活性を有する機能性抗体が得られることがわかった。得られたニカストリン抗体は、未変性のニカストリンのN端を認識し、γセクレターゼ複合体がコレステロールラフトに活性型としてコレステロール依存性に分布すること、またニカストリンが構造的にγセクレターゼ複合体の端に位置していることなどが示された。膜貫通領域での加水分解の機構を説明するモデルを示唆するものである。またGi-CFPとRGS10-YFPをリンカーでつなぐことにより、A1F刺激によりFRETを起こすプローブの作製に成功した。これらの結果は、BV上での膜タンパク質の発現系が膜タンパク質複合体解析に有用であることを示すものであると考えられた。
発表文献	Ogura T, Mio M, Hayashi I, Miyashita H, Fukuda R, Kodama T, Hamakubo T, Iwastubo T, Tomita T, sato C：　 "Three-dimensional structure of the γ-secretase complex." 　Biochemical and Biophysical Research Communications (印刷中). 　 (2006) 　 Daigo K, Sugita S, Mochizuki Y, Iwanari H, Hiraishi K, Miyano K, Kodama T, Hamakubo T.：　 "A simple hybridoma screening method for high-affinity monoclonal antibodies using the signal ratio obtained from time-resolved fluorescence assay." 　Anal Biochem. (印刷中). 　 (2006) 　 Tanaka T, Jiang S, Hamakubo T, Sakai J, Naito M, Kodama T.：　 "Dysregulated expression of P1 and P2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4alpha in the pathogenesis of human cancer." 　J Pathol. (印刷中). 　 (2006) 　 Saitoh R, Ohtomo T, Ito Y, Nezu J, Kimura N, Funahashi S, Aso Y, Ohizumi I, Kodama T, Hamakubo T：　 "Recovery of functional peptide transporter PepT1 in budded baculovirus fraction." 　Protein Expr Purif September 26. 　130-135　 (2005) 　 Tachibana M, Ueda J, Fukuda M, Takeda N, Ohta T, Iwanari H, Sakihama T, Kodama T, Hamakubo T, Shinkai Y.：　 "Histone methyltransferases G9a and GLP form heteromeric complexes and are both crucial for methylation of euchromatin at H3-K9." 　Genes Dev. April 1;19. 　815-826　 (2005) 　 Urano Y, Hayashi I, Isoo N, Reid PC, Shibasaki Y, Noguchi N, Tomita T, Iwatsubo T, Hamakubo T, Kodama T.：　 "Association of active gamma -secretase complex with lipid rafts." 　J Lipid Res. May46(5). 　904-912　 (2005) 　 Watanabe Y, Jiang S, Takabe W, Ohashi R, Tanaka T, Uchiyama Y, Katsumi K, Iwanari H, Noguchi N, Naito M, Hamakubo T, Kodama T：　 "Expression of the LXR{alpha} Protein in Human Atherosclerotic Lesions" 　Arterioscler Thromb Vasc Biol. March 25. 　622-627　 (2005)