発光タンパク質イクオリンの構造変化とその発光機構の解明

研究課題名	発光タンパク質イクオリンの構造変化とその発光機構の解明
レコードタイプ	研究実績報告
報告年度	2004
研究期間	2003-2004
研究課題番号	15710170
研究代表者	片山由貴子　 (カタヤマユキコ)　独立行政法人理化学研究所・タンパク質機能研究チーム・研究員
研究代表者番号	20342769
研究機関	独立行政法人理化学研究所　研究機関番号：82401
研究種目	若手研究(B)　研究種目コード：260
研究分野[3]	生物分子科学　研究分野コード：2401
キーワード	イクオリン / NMR / Mg^<2+>イオン / 構造変化
研究概要	昨年度中に、Mg^<2+>を添加することによりMg^<2+>結合型イクオリンについて非会合状態で良質のNMRスペクトルが長時間測定可能な条件を見いだした。NMR解析のために、^<15>Nおよび^<13>C均一標識イクオリンを調製する条件(培地、プラスミド、培養条件等)を検討し、400mLの培地から数mgの標識イクオリンを得られるまでに最適化した。その後、発現・精製した^<15>N,^<13>C均一標識イクオリンについて各種多次元NMR (^<15>N HSQC, ^<13>CHSQC, HNCA, HNCOCA, CCONH, HNCACB, CBCACONH, HNCO, HNCACO,および^<15>N NOESY-HSQC)を測定し、主鎖の各プロトンの化学シフトを帰属した。しかし、ループ部分あるいはその付近と予想されるアミノ酸残基のいくつかの帰属等に不正確さが残った。そこで、アミノ酸選択的標識イクオリンを調製した。具体的には、^<15>N標識したメチオニンを培地に加え、培養条件を検討し、^<15>N-メチオニン標識イクオリンを調製した。(イクオリンには5個のメチオニンが存在する。)この標識体を用いてNMR測定することにより、Mg^<2+>結合型イクオリンの主鎖帰属をほぼ完全に行うことができた。また、Mg^<2+>イオンの濃度を変化させたNMR測定、いわゆるNMR滴定実験を行った。これらのNMR測定結果から、イクオリンに3箇所存在するEFハンドへのMg^<2+>の親和性の違いを定量的に見積もること等ができた。本研究から、Mg^<2+>によるイクオリン安定化の機構、Ca^<2+>添加によるイクオリンの構造変化過程についての予測が可能になり、発光機構解明への重要な基礎データを提供できた。
発表文献	Wakana Ohashi, Satoshi Inouye, Toshio Yamazaki, Yukiko Doi-Katayama, Shigeyuki Yokoyama, Hiroshi Hirota：　 "Backbone ^1H, ^<13>C and ^<15>N resonance assignments for the Mg^<2+>-bound form of the Ca^<2+>-binding photoprotein aequorin" 　Journal of Biomolecular NAIMR (In press).